17 Ocak 2020 Cuma

 PROTEİN'lerin  Saflaştırılması

(Uzun zaman önce başladığım  -ve bir türlü devamını getiremediğim-  Aminoasitler ve Proteinler  serime devam ediyorum.)

PROTEİNLERİN MOLEKÜL AĞIRLIK TAYİNİ:
Çok büyük moleküller olduklarından dolayı, molekül ağırlıklarının tayininde kimyasal metotlar yerine fiziksel yöntemler tercih edilir: Ultrasantrifüj yöntemi  [Kolloidal özellikteki proteinler, devir sayısı çok yüksek olan (60.000 - 80.000 devir/dak)  ultrasantrifüjlerde çöktürülerek; çökme hızına göre ayrıştırılır],  Işık dağılımı yöntemi, Jel Filtrasyonu, Elektroforez (SDS-Page)  gibi...

Bir proteinin saflaştırılmasındaki ilk adım özütün (ekstraktın) hazırlanmasıdır. Hücreler çeşitli yöntemlerle parçalanır ve çözünme özelliklerine göre çeşitli sıvılar yardımıyla ilgili protein ekstrakte edilir. Lipidlerin aseton ve eter ile uzaklaştırılması,  bu işlemleri kolaylaştırır ve güvenilirliğini arttırır.

Ultrafiltrasyon (UF),  Jel filtrasyonu,  Elektroforez,  İyon değiştirme kromatografisi,  Afinite kromatografisi,  Diyaliz,  İsoelectric focusing,  Tuzlar ile çöktürme gibi yöntemler uygulanır.


DİYALİZ  /  Dialysis:
Proteinleri, daha küçük molekül ağırlığına sahip diğer moleküllerden ayırarak saflaştırmak için kullanılan bir yöntem.  Selofan tüpler kullanılır. (Ultramikroskobik porları, yani gözenekleri vardır.)

Selofan tüp içine konan bileşimdeki küçük moleküller, tüpteki porlardan ortama (distile su veya tampon çözeltiye) geçerken; büyük protein molekülleri tüp içinde kalır.


ULTRAFİLTRASYON  (UF):
Yarı-geçirgen bir membran.  Azot gazı ve basınç ile uygulama.
Basınç altında yarı geçirgen membrandan bir miktar sıvı ve bazı küçük moleküller geçip ayrılırken  proteinler geçemez  ve membran iç yüzeyinde birikir.  Bu yöntemle hem proteinler küçük moleküllerinden ayrılır  hem de sıvı kaybederek konsantre hale gelirler.  (Yoğurt ve peynir gibi fermente süt ürünleri yapımında,  buharlaştırma/evaporasyondan sonra protein bileşimini arttırmak için bu yöntem uygulanabilir.)

Permeat:  Membranlardan geçen sıvı kısım.
Retentat:  Membranları geçemeyip sistemde kalan büyük moleküllü kısım.


JEL FİLTRASYONU:

Proteinlerin molekül ağırlıklarına göre ayrımında kullanılan bir yöntem.  (Proteinlerin M.A.larının tayini  ve  büyüklüklerine göre ayrımı)

Ayrım sonunda büyük protein molekülleri kolondan ilk olarak çıkarken, daha sonra orta büyüklüktekiler ve en son olarak da en küçük protein molekülleri çıkar.  [Küçük moleküller,  kolon içindeki taneciklerin  (Sephadex, biyojel veya agaroz)  yapısındaki porlara/oyuklara yerleşip kolondan çıkmakta gecikmiştir. Yani porlara takılan küçük moleküller, çıkışa doğru daha yavaş sürüklenirler.]



ELEKTROFOREZ  /Electrophoresis:  Proteinleri ayırmak, saflaştırmak ve karakterize etmek amacıyla kullanılan bir yöntem.

Poliakrilamid jeller, tampon çözeltiler, iki adet cam levha,  + ve - elektrotlar (anot ve katot), enjeksiyon sistemi, tampon çözelti, tarak, stacking ve separating jel, su banyosu, DC güç kaynağı, Marker boya (brom-fenol mavisi),  boyalar (Caomasse blue)...

Yöntemin temeli:
Elektrik alan  (electric field)  etkisi altında iyonların hareket etmesi esasına dayanır.  Elektrik alana yerleştirilen bir karışımdaki proteinler, yükleri ile orantılı bir hızda göç ederler  ve  protein bantları elde edilir.

İzoelektrik noktalarından *  düşük pH'larda proteinler katota (- yüklü elektrot);  izoelektrik noktalarından yüksek pH'larda anota  (+ yüklü elektrot) doğru göç.

Proteinlerin hareketinde (mobility) net yük ve pH'nın yanı sıra moleküler büyüklük,  sürtünme katsayısı  ve  elektrik alanın gücü de önemlidir.
(Mobilite  ≈  Yük/Kütle)

Belli pH'daki bir tampon çözelti içinde ve bir taşıyıcı materyal üzerinde proteinler göç ettirilirler. Farklı göçme hızlarına göre taşıyıcı materyal üzerinde ayrılan proteinler  boyanarak görünür hale getirilirler.
Pahalı ve uzun süre isteyen bir yöntem. İyi bir ayrım için, kullanılan ayırıcı ortam proteinler ve tampon çözeltiler ile reaksiyona girmemeli, hareketi değiştirmemelidir.

Sabit ortam:  Jel
Hareketli ortam:  Tampon çözelti.  (pH'yı sabit tutarlar + taşıyıcı elektrolit)
Poliakrilamid jeller -> akrilamid / acrylamide + bisakrilamid (akrilamid yapısındaki çapraz bağlanmayı sağlar)
Amonyumpersülfat + TEMED (katalizör)
Merkaptoethanol: Sodyum Dodesil Sülfat yani SDS'nin proteinlere bağlanmasını ve böylece (-) yüklenmelerini sağlar. Ayrıca disülfit bağlarını parçalar ve bu sayede:  Globular (yumak şekilli) proteinler -> Fibröz (düz) proteinlere dönüşür.  Bu dönüşümle jel içindeki protein hareketi kolaylaşır.

(Akışkan özellikteki akrilamid jeller, çeşitli katalizör ve çapraz bağlama ajanlarının ilavesi ile çapraz şekilde bağlanarak polimerize olur ve katı yapı oluşturur. Polimerize olmamış halde iken akrilamid kuvvetli nörotoksik bir maddedir. Çalışırken eldiven kullanılmalı ve dikkatli olunmalı. Katılaşması sonrası oldukça dayanıklı bir malzeme olup işlemlerin sonunda yırtılıp parçalanmadan ortamdan alınarak üzerinde çalışılabilmekte.)

* Buğday Gluten proteinlerinin ekmeklik kalitesinin tespitinde HMW-Gluten miktarı önemli ve elektroforez bantları konu hakkında fikir verebilmekte.

Ek Bilgi:
Gıda proteinlerinin tayininde elektroforez tekniği çok geniş uygulama alanı bulur. Buğday ve buğday ürünlerindeki protein fraksiyonları bu sayede ayrılabilmekte. Elektroforez süt proteinlerinin ayırımında da kullanılmakta. Sütün başlıca proteini olan kazein elektroforezden önce pH 4.6'da asetik asit ile çöktürülerek fraksiyonlarına ayrılmaktadır.  Laktalbumin  α, β ve γ laktoglobulinler olarak ayrılabilmektedir.  Yumurta akı içerisinde bulunan yumurta proteinleri de karakteristik elektroforez bantları ile belirlenebilir.

Elektroforez hile amacıyla yapılan karışımların belirlenmesinde etkili bir yoldur.  Yoğurda hile amacıyla katılan jelatin proteinleri, normal süt proteinlerinden bu yolla ayırt edilebilmekte.  (Yoğurda % 0.05 oranında katılan jelatin tespit edilebilir.)   Koyun ve inek sütlerinden yapılmış çeşitli peynirlerin gerçek hammaddesinin belirlenmesinde vs.  Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin saflığının kontrolünde, oligo nükleotidlerin analizinde, proteinlerin moleküler ağırlıklarının tespitinde, proteinlerin izoelektrik pH'larının belirlenmesinde ve enzimlerin preparatif eldesinde de kullanılabilir.


SDS-Page (Sodyum Dodesil Sülfat PoliAkrilamid Jel/Gel) Elektroforezi en çok kullanılan elektroforez yöntemidir. Diğer bir yöntem olan Asit-Page ile aralarındaki farkı aşağıdaki tabloda özetlemeye çalıştım:



İZOELEKTRİK FOCUSING  (IEF):   "Electrofocusing"  de denir.
Farklı molekülleri,  elektrik yüklerinin ve izoelektrik noktalarının farklılığına göre ayırma üzerine dayalı bir tekniktir.  ("A technique for separating different molecules by their electric charge differences.")  Ortamın pH'sı değiştiğinde,  protein moleküllerin yükleri de değişecektir.

_Elektrik alanda bir protein molekülünün hareketi, kendi izoelektrik noktasına gelindiğinde durur.   (İzoelektrik noktada net yük=0)

Özellikleri birbirine benzeyen proteinlerin birbirinden ayrılmasında geleneksel elektroforez yöntemlerine göre daha başarılı sonuçlar elde edilmekte.
Çok sayıdaki balık türüne ait etlerin ayrımı ve kontrol edilmesinde kullanılır.  (Bunun için özel bir balık türü için spesifik olan protein bantına bakılır.  Her balık türüne özgü protein bantı deseni çıkartılmalı.)
_İyi bir analiz için çok iyi hazırlanmış örnek preparatlarına ihtiyaç vardır.



İYON DEĞİŞTİRME KROMATOGRAFİSİ  /  Ion Exchange Chromatography:
Asidik ve bazik proteinleri birbirinden ayırmada.
Kolon maddesi olarak nötral pH'da artı-yüklü olan Dietilaminoetil selüloz (DEAE-Cellulose) kullanılırsa => (-) yüklü maddeleri bağlamasıyla diğerleri (bazik) kolondan ayrılır.

eksi-yüklü Karboksimetil selüloz (CM-Cellulose) kullanıldığında => (+) yüklü (bazik) aminoasitler kendisine tutunarak (-)  yüklüler (asidik) kolondan ayrılır.


AFFİNİTE KROMATOGRAFİSİ  /  Affinity Chromatography:
Çok kompleks bir karışımdaki enzimleri, hormonları, veya antikor ve antijenleri ayırmada yararlanılan, seçiciliği fazla olan bir yöntem. Bir enzim solusyonunu saflaştırmak ve konsantre etmek gibi kullanım alanları var. (Antijen-Antikor, Enzim-Substrat, Reseptör-İlaç etkileşimleri)



Tuzlar ile çöktürme:
Amonyum sülfat (NH4)2SO4, sodyum sülfat Na2SO4, magnezyum sülfat MgSO4 veya bakır tuzları ile çöktürme.  Proteinlerin izolasyonu ve saflaştırılmasında kullanılan en eski ve en çok kullanılan yöntemlerden biri. Kristal halde elde.  Tam doymuş amonyum sülfat çözeltisi albüminleri çöktürür mesela.  Globulinler ise daha düşük konsantrasyonlu amonyum sülfat çözeltilerinde de çökeldiklerinden,  çözünürlük farkından yararlanarak ayırma.

Tuzlarla çöktürme, proteinlerin denaturasyonuna neden olmaz. Bu şekilde çöktürülmüş proteinleri yeniden çözündürmek mümkündür.




* İzoelektrik Nokta  (pI):  Bir aminoasitin  Zwitterion  forma geçtiği,  yani net yükünün  0  olduğu pH.  Her aminoasit için pI değeri karakteristiktir.

Nötral aminoasitler için pI:  4.8-6.3
Asidik   "   "   "   "   "  :   2.7-3.2
Bazik    "   "   "   "   "  :   7.6-10.8

Asit ortamda aminoasitler :  +  yüklü   (katyon halinde)
Alkali/Bazik ortamda  "  "  :   -  yüklü   (anyon halinde)
İzoelektrik nokta pH'sında:  Net yük=0  (Elektrik alan içerisinde hareketsiz)


Izoelektrik nokta (pI) altındaki pH derecelerindeki bir protein molekülü pozitif (+) yüklüdür ve elektrik alanda katota (- yüklü elektrota) göç eder. pI'ye yaklaşıldığında hareketi yavaşlar ve bu değerde tamamen durur.

("A protein that is in a pH region below its isoelectric point (pI) will be positively charged and so will migrate towards the cathode. As it migrates through a gradient of increasing pH, however, the protein's overall charge will decrease until the protein reaches the pH region that corresponds to its pI.  At this point it has no net charge and so migration ceases  as there is no electrical attraction towards either electrode.")

** Zwitterion:  Belirli bir pH'da hem (+) hem de (-) yüke sahip olup net yükü sıfıra eşit olan bileşikler Zwitterion formdadır.  (amfolit)

_Aminoasitler ve proteinler amfolit/amfoter bileşiklerdir.  (Aside karşı baz,  baza karşı asit gibi davranan maddeler hem asit hem de baz etkisi gösterirler. Bu durum amino grubu ile birlikte karboksil grubu da içermelerinden kaynaklanır.  Bu nedenle tampon özelliği gösterirler.)


KAYNAKLAR:

•  Bu derlemede özellikle şu kaynaktan ve görsellerinden oldukça yararlandım:   http://www.mustafaaltinisik.org.uk/89-1-07.pdf

•  Pagif Tekniği anlatılmış ve bir-iki genel bilgi var:  http://vfdergi.yyu.edu.tr/archive/2003/14_2/2003_14_(2)_102-106.pdf


Hiç yorum yok: